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初學(xué)者:RNA提取原理

更新時間:2020-05-11      點(diǎn)擊次數(shù):3493

 

RNA提取原理
RNA提取時,加lv仿后分三層:水相(含rna,可能還有少量DNA),中間白色薄層(應(yīng)該是蛋白和DNA),下層有機(jī)相(lv仿和蛋白等)
lv仿是分子量比較大的有機(jī)溶劑,在提取RNA時,lv仿可以有效的使有機(jī)相和無機(jī)相迅速分離。DNA提取過程 有機(jī)相中主要是酚和蛋白結(jié)合,從而使得蛋白和DNA脫離,DNA進(jìn)入水相。但是在RNA的提取過程就要避免蛋白和DNA脫離,否則DNA會釋放到水相。不管有酚也好,沒有酚也好,lv仿本身也對蛋白有變性作用,劇烈的震蕩,很容易使得DNA的親水基團(tuán),與水相接觸。所以不要劇烈震蕩。

yi丙醇的作用是通過-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA鏈中的親水基團(tuán)受到保護(hù),等同于沉淀,但是這是個反應(yīng)時發(fā)生在水相中,與前面的lv仿不矛盾。
lv仿的作用有多個方面,一是作為有機(jī)溶劑變性蛋白,使其沉淀并通過離心除去,同時也通過變性作用抑制RNase活性;二是RNA提取試劑中通常含有ben酚(Trizol主要成分就是ben酚,很多自己配試劑提的方法也用ben酚,抽提蛋白時也會用到ben酚),ben酚微溶于水,抽提烷之后水相里有痕量的酚,如果不除去會損傷核酸,需要通過lv仿把水相里參與的ben酚抽提掉;三是作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質(zhì)(比如油脂、脂溶性色素等),起到一定除雜作用。
因?yàn)榧?xì)胞中存在DNA酶,在提取之前細(xì)胞破碎的時候沒有加DNA酶抑制劑,DNA已經(jīng)被分解了。上層水相,PH 5.1左右,當(dāng)溶液pH在酸性的時候,DNA分子就會沉淀在酚與溶液的界面,只有RNA分子留在水相。而當(dāng)pH接近中性時,DNA就會溶解在水相,(導(dǎo)致PH中性的大概原因是trizol與樣品比例不對,應(yīng)該盡量保證提取量的前提下使trizol過量)
TRIzol Reagent 提取total RNA步驟:
1. 查下表根據(jù)樣品量選擇適當(dāng)?shù)?TRIzol Reagent體積裝入50ml RNase-free離心管中,注意樣品體積不能超過TRIzol Reagent體積的10%。

組織量

TRIzol Reagent

lv仿

yi丙醇

75%乙醇

50~100mg

1ml

0.2ml

1ml

1ml

2.將組織樣品放入TRIzol Reagent中,高速下勻漿15-30秒/次,直至看不見組織和細(xì)胞碎片。
3.室溫溫育10分鐘。
4. 據(jù)表2加入適量體積的lv仿,劇烈震蕩15秒鐘,然后室溫下溫育3分鐘。
5. 4ºC,12000g離心15分鐘,形成淡紅色的ben酚/lv仿有機(jī)相,中間相和上層水相,水相約占TRIzol體積的60%。
6. 轉(zhuǎn)移上清于另一個Rnase-free的 50ml離心管中。根據(jù)表2加入適量yi丙醇,-20ºC沉淀1小時以上。
7. 4ºC,12000g離心10分鐘。
8. 去上清,據(jù)表2加入適量體積的75%的乙醇混勻。
9. 4ºC,7500g離心5分鐘。
10.去上清,空氣中干燥或真空抽干RNA沉淀,但不要太干。加入適量體積的DEPC-WATER,溶解沉淀。
11.取少量RNA用于測定其OD值和電泳,其余置-80ºC冰箱中保存,

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